MODIFIZIERTES MACROMOLEKÜL - EP1981512B1 - Patent Guru (2023)

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[0194]当赖氨酸树枝状聚合物必须含有氚以便使用闪烁计数在生物基质中检测到树枝状聚合物材料时，这些材料通过稀释（4.5-^3个H)-L-赖氨酸与非放射性 L-赖氨酸提供的材料具有每毫克 5 µCi 至 15 µCi 范围内的比活性。然后使用这种氚化赖氨酸制备二 Boc-赖氨酸的活性对硝基苯酚酯，使用美国专利 5,678,888 中描述的方法将其掺入目标赖氨酸树枝状聚合物的外赖氨酸层中。

示例 4*

BHAlys的合成[(^3个H)-Lis]_8个[_丁-赖氨酸]_十六[N.H_2个]₃₂

[0195]对于 BHAlys [(^3个H)-Lis]_8个[N.H_2个.TFA]_十六(38 mg, 0.01 mmol) 在氮气下的干燥 DMF (3 mL) 中，_丁- 在 DMF (4 mL) 和三乙胺（65 µL，0.46 mmol）中的赖氨酸（181 mg，0.38 mmol）的对硝基苯酚酯。将反应混合物在室温下搅拌16h，之后将其倒入乙腈(60ml)中并搅拌6h。通过0.45μm亲水性聚丙烯膜过滤器过滤收集所得细小固体并在真空中干燥。产物 BHAlys [(^3个H)-Lis]_8个[_丁-赖氨酸]_十六[书]₃₂它是一种精细的灰白色固体（40 毫克，56%）。 BHAlis [(^3个H)-Lis]_8个[_丁-赖氨酸]_十六[书]₃₂(34 mg, 0.005 mmol) 悬浮于 CH_2个钾_2个(1 mL) 并冷却至 0 °C。滴加 TFA（398 µL，2.58 mol）并将反应在 0 °C 下搅拌 10 分钟，然后升温至室温并再搅拌 3 小时。真空除去溶剂，将乙醚加入所得油状物中，研磨溶液导致形成白色固体。倒出乙醚并用乙醚(x3)洗涤固体。除去乙醚后，将所得固体溶解在最少量的水中，并应用于 Amberlyst (A-26 OH) 离子交换柱。从柱中收集 100 mL 水并冻干以产生 BHAlys [(^3个H)-Lis]_8个[_丁-赖氨酸]_十六[N.H_2个]₃₂白色固体（15 毫克，79%）。

示例 5*

阳离子树枝状材料的血浆清除率和生物分布研究

[0197]缓冲试剂为 AR 级。水来自 MilliQ 净水系统（Millipore，澳大利亚）。肝素 (10,000 IU/ml) 购自澳大利亚 Faulding。注射用生理盐水装在 100 毫升聚乙烯袋中，购自 Baxter Healthcare Pty Ltd（澳大利亚新南威尔士州）。氚化 L-赖氨酸 (1 mCi/ml) 购自 MP Biomedicals (Irvine, CA, USA)。非放射性标记的 L-赖氨酸购自 Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA)。 Starscint 闪烁混合物和 Soluene 350 组织溶剂购自 Packard Biosciences (Meriden, CT)。蛋白质标准品包括蓝色葡聚糖 2000 (2000 kDa)、无脂肪酸牛血清白蛋白 (67 kDa)、胃蛋白酶 (35 kDa)、胰蛋白酶 (23.8 kDa)、肌红蛋白 (17.6 kDa)、核糖核酸酶 A (13.7 kDa)、细胞色素 C (12.4 kDa) 和维生素 B12 (1.4 kDa) 均购自 Sigma Chemical Co（美国密苏里州圣路易斯）。通过将 20 µL Precision Plus 蛋白质标准品注入色谱柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）获得更高分子量蛋白质的洗脱时间。

[0199]^3个H-L-赖氨酸 (25 µCi) 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 中用非放射性标记的赖氨酸新鲜稀释至 20 µCi/mg 的最终比活性，用于 IV 给药。

[0200]所有树枝状聚合物均在 PBS 中稀释并冷冻在 -20 °C 直至使用。

活度测定和闪烁计数

[0201]通过一式三份在 PBS 中稀释含有已知质量的储备溶液来确定树枝状聚合物的比活性。然后将等分试样添加到 1 mL Starscint 中，并在 Packard Tri-Carb 2000CA 液体闪烁分析仪（Meriden，CT）上对闪烁进行计数。三次重复测定的平均值用于所有后续计算。

体内方法

[0202]所有动物试验方案均已获得澳大利亚维多利亚州帕克维尔莫纳什大学维多利亚药学院动物伦理委员会的批准。

静脉药代动力学研究

生物分布研究

[0204]了解树枝状聚合物的命运生活，对不同主要器官的生物分布进行了检查。药代动力学研究完成后（30 小时），通过注射致死剂量的戊巴比妥钠处死动物，并解剖以下组织：心脏、肺、肝脏、脾脏、胰腺、肾脏和大脑。在组织处理和分析之前，将组织冷冻 (-20 °C) 储存在预先称重的聚丙烯管中。

[0205]最初通过在 Waring 小型混合器（Extech Equipment Pty. Ltd., Boronia, Australia）中以 5 x 10 秒的间隔将样品与 5-10 ml MilliQ 水均质化来处理组织。在开发一种方法来测量组织样本中相对较低水平的放射性时，发现了化学发光反应和颜色淬灭的问题，导致背景计数在闪烁计数中大幅波动。这些问题似乎也会因温度升高、暴露在光线下和样品搅动而加剧。为了克服这些问题，组织的后处理分两步进行。

[0207]在组织计数程序的第二个“分析”阶段，组织样本一式三份进行测试。来自未处理小鼠的空白组织也按上述方法处理（尽管一式三份）以提供背景校正。来自树枝状聚合物处理的小鼠的组织匀浆以与上述选择步骤中描述的大致相同的方式处理，除了采取额外的步骤来校正由于“淬灭”过程导致的放射性计数（淬灭）效率的降低。” .组织提取。为了校正计数效率，以相同方式处理来自治疗小鼠的第二组相同组织，但最初在添加 Soluene 之前添加已知量的放射性标记的树枝状聚合物。组织的活性被添加到大约一个水平等于在检测样品中测量的值（因此需要检测数据）然后计算处理效率如下，其中

$$\mathrm{效率}=\frac{\mathrm{经验丰富的}{\mathrm{组织}}_{\mathrm{DPM}}-{\mathrm{组织}}_{\mathrm{DPM},绎}}{\mathrm{经验丰富的}{\mathrm{溶液}}_{\mathrm{DPM}}}$$

[0208]钉布_DPM在加标组织样本中测得的质量校正放射性是多少？_DPM，过去是组织样品中的质量校正放射性，其中没有添加额外的放射性峰，而 Soln 添加了_DPM是添加到加标样品中的已知量的额外放射性。事实上，计算给出了计数效率的指示，使用每个组织中已知的（高）放射性量作为参考。

[0209]然后将该效率值用于校正。^3个处理后样品中的H含量在哪里

$${\mathrm{组织}}_{\mathrm{DPM},\mathrm{收集}}=\frac{{\mathrm{组织}}_{\mathrm{DPM},绎}}{\mathrm{效率}}$$

[0210]接下来，在知道处理样品中存在的整个器官质量分数的情况下，计算整个器官活动。结果表示为在处死时注射到器官中的剂量的百分比或每克组织的注射剂量的百分比。由于过程的可变性，无法轻易确定每种组织的 LOQ。相反，如果无法获得可重现的数据，导致 %CV 大于 20% 的一式三份样本将被复制或归类为低于可量化水平。

全血药代动力学

[0211]为了确定全血药代动力学，不同的动物组接受相同数量的树枝状聚合物溶液和全血样本 (150 µl)，这些样本在用于血浆收集的相同标称时间段内收集在肝素化 Eppendorf 管中。将每个血样的一式两份 (50 µl) 置于 2 x 20 ml 闪烁瓶中。最初，一个小瓶未经处理，而另一个小瓶中加入了已知量（所研究的树枝状聚合物每分钟 -300-600 次计数 (DPM)）以提供全血的功效数据（如上所述）。然后将样品在 60°C 下溶解在 4 mL 1:1 比例的 Soluene-350 和异丙醇中过夜。然后将样品冷却并用 200 µl 过氧化氢 (30% w/v) 漂白，然后加入 Starscint (12 ml)。然后将样品在闪烁计数之前在室温下放置 24 小时。通过与如上所述的加标样品获得的数据进行比较，对从血液样品获得的计数进行效率校正。

尿液和粪便

[0213]在三个时间间隔从给予树枝状聚合物的大鼠收集尿液：给药后0-8小时、8-24小时和24-30小时。在给药前还收集了从每只大鼠获得的空白尿样。将每个时间点的 100 µl 等份尿液加入到 1 ml 闪烁液中，并在闪烁计数前涡旋混合该混合物。减去背景后，针对该时间间隔内收集的尿液总量校正样本的放射性标记含量，并转换为总给药量的百分比。^3个剂量 h.

药代动力学计算

[0215]利用放射性标记的树枝状聚合物的比活性，将血浆/全血样品中的放射性标记浓度转化为 ng 等效浓度。这些浓度在整篇文章中以 ng 当量/mL 表示，但应该注意这种方法假定^3个放射性标记 H 仍然与完整的树枝状聚合物相关联，如下所述，在某些情况下情况并非如此。

示例 6*

实施例5的生物样品的体积排阻层析

[0217]已经使用各种方法来检查血浆样品中存在的物质的大小。首先，通过 PD10 凝胶过滤柱 (Pharmacia) 洗脱血浆样品并通过重力收集级分来进行粗粒度分离。在该方法中，血浆样品 (500 µl) 在上样到预平衡的 PD10 柱顶部之前用 2 ml PBS 稀释。将级分 (500 µl) 手动收集到微量离心管中，并在闪烁计数之前将 100 µl 等分试样添加到 1 ml 闪烁液中。 PBS 中的完整树枝状聚合物和赖氨酸溶液也通过色谱柱洗脱，以表征纯组分的保留体积。

[0219]为了获得血浆中存在的高 MW 放射性标记物质的更好分辨率，还使用 ​​Superdex 75 HR 10/30 尺寸排阻柱分析样品。以 1 分钟的间隔再次收集等分试样 (0.5 ml)，在 Starscint (3 ml) 中稀释并通过液体闪烁计数分析每个级分中的放射性。蛋白质标准用于生成标准曲线（线性 R^2个= 0.9915)，用于估计洗脱蛋白的分子量。使用 Waters 486 UV 检测器（Millipore Corporation，Milford，MA，USA）在 280 nm 处监测蛋白质洗脱。使用 Blue Dextran 2000 确定柱的死体积。

示例 7*

氚化阴离子树枝状聚合物的合成

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[CO-3,5-Ph(SO .)_3个的）_2个]₃₂

[0220]将 PyBOP (9.56 g, 18.37 mmol) 添加到搅拌的树枝状聚合物溶液 (BHALys [^3个H-李]_十六[N.H_2个.TFA]₃₂) (2.12 g, 0.27 mmol) 在 DMF/DMSO (1:1) (200 mL) 中。逐渐加入 3,5-二磺基苯甲酸 (5.39 g, 19.11 mmol) 和二异丙基乙胺 (12.2 mL, 70.02 mmol) 在 DMF/DMSO (1:1) (150 mL) 中的溶液。形成粘点。移出 ppt，重新溶解在 DMSO 中并返回到反应中。将混合物在室温搅拌16小时。将反应混合物倒入水(3.5L)中并通过0.45微米过滤器过滤。

[0221]在 Centramate（3K 膜，2 L 样品容器）上通过切向流过滤进行纯化。在初始 Milli-Q 水洗 (18 L) 后，用 Milli-Q 水洗 (1 L) 分离三份 1 M 碳酸钠 (100 mL) 洗涤渗余物，然后继续过滤直至 pH 值滤液达到。它是中性的（约 20 升）。反复尝试是浓缩的。在吸尘器中冻干得到所需产物，为灰白色固体 (2.34 g, 61%)。

[0222]1H RMN (300 兆赫, D_2个O) λ (ppm): 1,0-2,0 (186H); 2,8-3,4 (62H); 4,0-4,4 (31H); 5,9 (1H); 7,0-7,3 (10H); 8,1-8,3 (96H)。

[0224]EC（pH 值 3）：98.6 %无线电频率（分钟）= 10.97

[0225]EC（pH 值 9）：97.6 %无线电频率（分钟）= 12.90

BHAlys 的制备 [^3个H-李]_8个[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]_十六

[0226]将 PyBOP (303 mg, 0.58 mmol) 添加到树状聚合物 (BHALys [^3个H-李]_8个[N.H_2个.TFA]_十六) (68 mg, 17.3 µmol) 溶于 DMF (5 mL)。逐渐加入 4-磺基苯甲酸单钠盐（124 毫克，0.55 毫摩尔）和二异丙基乙胺（386 微升，2.22 毫摩尔）在 DMSO/DMF（5 毫升/10 毫升）中的溶液。将混合物在室温下在氩气下搅拌24小时，之后将其倒入水(200mL)中并通过0.45微米过滤器过滤。在用水 (1.5 L) 冲洗过的 Minimate（1K 膜，250 mL 样品容器）上通过切向流过滤进行纯化。渗余溶剂在压力下减少。将产物重新溶解在水 (5 ml) 中并通过 Sephadex 尺寸排阻柱（LH20，洗脱剂：水）并收集级分 1-8。合并的分数是浓缩的。在真空下，通过离子交换柱（69F，Na+）并冻干得到所需产物 BHALys [^3个H-李]_8个[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]_十六白色固体（20 毫克，22%）。

[0227]1H RMN (300 兆赫, D_2个O) λ (ppm): 1,0-1,9 (90H, CH2); 2,8-3,3 (30H, CH2); 4,0-4,4 (15H, CH); 5,9 (1H, CH); 7,0-7,2 (10H, Ar-H); 7,5-7,8（64H，Ar-H）。

[0228]MS（直接注入）：ESI (-ve) m/z = 5406 (M-H)- (M-，钠型)

[0229]计算值（钠型）(C215H257N31O79Na16S16) 5404 (M-)。

[0230]CE (pH 7): 91 % Rf (min) = 10.51

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]₃₂

[0232]1H RMN (300 MHz, D2O) λ (ppm): 1,0-1,9 (186H, CH2); 2,8-3,2 (62H, CH2); 4,0-4,4 (31H, CH); 5,9 (1H, CH); 7,0-7,2 (10H, Ar-H); 7,5-7,8（128H，Ar-H）。

[0233]MS（直接输注）：ESI (-ve) m/z = 10756 (M-H)- (M-，钠型)

[0234]计算值（钠型）(C423H481N63O159Na32S32) 10754 (M-)。

[0235]CE (pH 9): 98 % Rf (min) = 12.17

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[腐败_2个CH_2个（一氧化碳_2个时代）]₃₂

[0236]对于树枝状聚合物 (BHALys [^3个H-李]_十六[N.H_2个.TFA]₃₂) (32 mg, 4.1 µmol) 和三乙胺 (36 µl, 0.26 mmol) 的 DMF (5 mL) 溶液用琥珀酸酐 (26 mg, 0.26 mmol) 处理。将混合物在氩气下于室温搅拌24小时。将反应混合物倒入水(50ml)中并通过0.45微米过滤器过滤。在 Minimate（1K 膜，70 mL 样品容器）上通过切向流过滤进行纯化。在用 NaHCO3（饱和）(100 mL) 初步洗涤后，用水 (1.5 L) 洗涤渗余物。渗余溶剂在压力下减少。将产物重新溶解在水 (2 mL) 中，通过离子交换柱 (69F，Na+)，然后冻干得到所需产物 BHA Lys [^3个H-李]_十六[腐败_2个CH_2个（一氧化碳_2个时代）]₃₂白色固体（17 毫克，52%）。

[0237]1H RMN (300 MHz, D2O) λ (ppm): 1,0-1,8 (186H, CH2); 2,3-2,7 (128H, CH2); 2,9-3,2 (62H, CH2); 4,0-4,2 (31H, CH); 6,0 (1H,CH); 7,1-7,3（10H，Ar-H）。

[0238]MS（直接注入）：ESI (-ve) m/z = 7360 (M-H)-（M-，H 形）

示例 8*

阴离子树枝状聚合物的消除研究和等离子体生物分布

[0241]本研究中使用的方法与实施例 5 中使用的方法相同。

[0243]注射生物分布^3个H 静脉注射 BHALys [Lys] 后 30 小时_8个[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]_十六（黑人），BHAlys [Lys]_十六[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]₃₂(浅灰色)、BHA灯[Light]_十六[CO-3,5-Ph(SO .)_3个的）_2个]₃₂(gris oscuro) o BHALys [赖氨酸]_十六[CO-NUR_2个CH_2个（一氧化碳_2个时代）]₃₂（白色）用于小鼠，如图所示图 11. A 区 - 注入百分比^3个H 由器官呈现。 B 区 - 注入百分比^3个每克组织中存在的 H。

例 9*

实施例8的生物样品的尺寸排阻色谱

[0244]本研究中使用的方法与实施例 6 相同。

[0245]BHAlys [Lys] 尺寸排阻概况_十六[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]₃₂e BHALys [赖氨酸]_十六[CO-3,5-Ph(SO .)_3个的）_2个]₃₂Superdex 75 色谱柱上的血浆和尿液浓度如图所示图 12.

示例 10*

氚化聚乙二醇树枝状聚合物的合成

BHAlys 的制备 [^3个H-李]_8个[关联₂₀₀]_十六

[0247]LC/MS (TFA filico)：Rf (min) = 16,72。 ESI (+ve) m/z = 5598 (M+H⁺).

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[关联₂₀₀]₃₂

[0248]对于 BHAlys 的搅拌溶液 [^3个H-李]_十六[N.H_2个.TFA]₃₂在氩气下，加入 PyBOP (142 mg, 0.271 mmol) (30 mg, 0.004 mmol) 的 DMF (3 mL) 溶液，然后加入 PEG 200 (62 mg, 0.263 mmol) 溶液，N,N- DMF (3 mL) 中的二异丙基乙胺（182 µL，1.04 mmol）。将该溶液在室温下搅拌16小时。在减压下除去溶剂并将所得粗混合物溶解在最小体积的水中。使用水作为洗脱剂通过 Sephadex 柱 (LH-20) 进行纯化，得到所需的产物 BHALys [^3个H-李]_十六[关联₂₀₀]₃₂通过冷冻干燥除去水后为白色固体（20 毫克，44%）。

[0249]LC/MS (TFA Filico)：Rf (min) = 16,74 ESI (+ve) m/z = 11,141 (M+H⁺).

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[关联₅₇₀]₃₂

[0250]对于 BHAlys 的搅拌溶液 [^3个H-李]_十六[N.H_2个.TFA]₃₂在氮气下，加入无水 DMF (2 mL) 中的 (20 mg，0.003 mmol)、三乙胺 (36 µL，0.261 mmol) 和 PEG 685.75、NHS 酯 (119 mg，0.174 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将溶液倒入 5K 摇动池中，使水 (600 mL) 通过池，通过冷冻干燥 (x2) 去除残留的水，得到 BHALys [^3个H-李]_十六[关联₅₇₆]₃₂作为玻璃状固体（50 毫克，88%）。 LC（亲和性 TFA）：Rf（最小值）12.42。

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_8个[关联_2KD]_十六

BHAlys 的制备 [^3个H-lis]_十六[关联_2KD]₃₂

[0252]对于 BHAlys 的搅拌溶液 [^3个H-李]_十六[N.H_2个.TFA]₃₂(30 mg, 0.004 mmol) 在无水 DMF (2 mL) 中，在氩气下，加入 PyBOP (142 mg, 0.272 mmol)，然后加入 PEG 2000、NHS 酯 (522 mg, 0.261 mmol) 的溶液，N,N- 在 DMF (3 mL) 和 DMSO (1 mL) 中的二异丙基乙胺（182 µL，1.04 mmol）。将该溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物倒入水中，过滤并用水洗涤。在 Mini-Mate（10K 膜，2L 水）上通过切向流过滤进行纯化。通过冷冻干燥除去溶剂，得到 BHALys [^3个H-李]_十六[关联_2KD]₃₂作为自由流动的白色固体（210 毫克，76%）

示例 11*

PEG树枝状聚合物的血浆清除率和生物分布研究

[0255]BHALys [Lys] 的血浆浓度时间曲线_十六[关联₂₀₀]₃₂（实心圆圈），BHALys [Lys]_十六[关联₅₇₆]₃₂（空心圆），BHAlys [Lys]_8个[关联₂₀₀₀]_十六（闭合三角形）和 BHALys [Lys]_十六[关联₂₀₀₀]₃₂（空心三角形）显示在图 13. BHALys [Lys] 的数据_8个[关联₂₀₀]_十六未显示，因为擦除速度极快且被 BHAlys [Lys] 数据遮挡_十六[关联₂₀₀]₃₂

[0256]BHALys [Lys] 的生物分布_十六[关联₂₀₀₀]₃₂（黑条，7 天），BHALys [Lys]_8个[关联₂₀₀₀]_十六（灰色条，5 天）和 BHALys [Lys]_十六[关联₅₇₆]₃₂（白色条，30 小时）在 IV 给药后显示在图 14.

示例 12*

实施例 11 的生物样品的体积排阻层析

[0257]本研究中使用的方法与实施例 6 相同。

[0259]大小排阻配置文件^3个IV 后 H 它在 BHALys [Lys] 给药后随尿液排出。_十六[关联₂₀₀]₃₂（图 A；0-4 小时尿液，闭合圆圈，8-24 小时尿液，空心圆圈）和 BHALys [Lys]_十六[关联₅₇₆]₃₂（图 B；8-24 小时尿液）如图 16A 和 B 所示。箭头表示完整树枝状聚合物的保留时间。

概括

[0260]申请人进行了一项研究^3个H(-标记的聚-L-赖氨酸树枝状聚合物，其中 BHALys [Lys]_8个[N.H_2个]_十六o BHA 列表 [学习]_十六[N.H_2个]₃₂准备好，表面裸露。为了比较：由 BHALys [Lys] 组成的第三种树枝状聚合物_8个[N.H_2个]_十六细胞核完全被 D-赖氨酸覆盖，形成一个 Lys_十六树状聚合物如何_丁-其外层的赖氨酸 BHALys [Lys]_8个[D-李]_十六[N.H_2个]₃₂也被检查了。在所有情况下，树枝状聚合物在生理 pH 值下都被阳离子氨基覆盖。测定了这些材料的血浆清除率和生物分布（实施例 5）。任何一个居住的命运^3个通过使用尺寸排阻色谱分离存在于血浆中的不同放射性标记物质来进一步检查 H 树枝状聚合物（实施例 6）。数据表明，聚-L-赖氨酸树枝状聚合物在静脉内给药后迅速从血浆中清除，但随后被代谢，释放的 L-赖氨酸重新掺入内源性树脂合成过程。

[0262]总之，最近的数据表明，未受保护的聚-L-赖氨酸树枝状聚合物通过静脉内注射迅速从血浆中清除，并且最初与完整树枝状聚合物相关的放射性示踪剂在随后的时间点再次出现在与共洗脱的聚-L-赖氨酸物种相关的血浆中。赖氨酸、游离赖氨酸和几种较高分子量的赖氨酸。重量材料（可能是蛋白质），包括白蛋白。数据还表明，高电荷阳离子树枝状聚合物在注射后立即迅速结合到内皮细胞表面，随后水解产生自由循环的赖氨酸，最终重新整合到蛋白质生物合成途径中。据我们所知，这些数据首次描述了聚-L-赖氨酸树枝状聚合物在体内的生物降解和摄取。因此，适当操纵聚-L-赖氨酸树枝状聚合物的表面特性可以增加等离子体的初始停留时间。因此，未加帽的聚-L-赖氨酸表面可以提供可生物降解和可生物再吸收的基于树枝状聚合物的药物递送系统。

【0263】另一项研究调查了用阴离子芳基磺酸盐基团或烷基羧酸盐基团包覆聚-L-赖氨酸树枝状聚合物核心表面对大鼠静脉内给药后树枝状聚合物的药代动力学和生物分布模式的影响。

【0265】血浆浓度-时间曲线显示 BHALys [Lys] 的血浆清除率和分布容积_8个[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]_十六它比赖斯的那个大_十六树枝状聚合物，尽管所有四种树枝状聚合物的消除半衰期基本相同（大约 1 小时）。大约 30% 的注射放射性标记与 BHALys [Lys] 相关。_8个[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]_十六e BHALys [赖氨酸]_十六[CO-4-Ph(SO .)_3个时代）]₃₂树状聚合物在给药后 30 小时内从尿液中排出，而高负荷剂量的 BHALys [Lys] 中只有 3%_十六[CO-3,5-Ph(SO .)_3个的）_2个]₃₂同期随尿液排出。

【0266】琥珀酸树枝状聚合物的清除曲线与其他阴离子树枝状聚合物明显不同，琥珀酸树枝状聚合物通过静脉内注射非常迅速地从血浆中清除。初始分布容积 (Vc) 也大于其他阴离子树枝状聚合物并接近阳离子树枝状聚合物，表明与血液或内皮表面成分的初始相互作用迅速从血浆中清除放射性示踪剂。图 4).血浆中前 20 分钟的初始损失率也非常快，并且再次发生在与阳离子树枝状聚合物类似的时间尺度上。在最初的快速下降之后，放射性示踪剂似乎被更慢地消除，在给药后 30 小时内仍有可测量的放射性示踪剂。不知道第二个较慢的消除速率是否反映了标记物重新分布回血浆，如先前在阳离子系统中观察到的那样。阴离子树枝状聚合物似乎几乎完全排除在红细胞之外。与其他阴离子树枝状大分子不同，大多数与琥珀酸盐树枝状大分子相关的注射放射性示踪剂在尿液中排泄 (63.71 ± 8.98%)，而在尿液中回收了非常少量但可量化的放射性示踪剂。合并粪便（ 1.21 ± 0.97%)。 （表3）。

[0268]因此，阴离子树枝状聚合物的血浆清除比以前观察到的未受保护的阳离子聚-L-赖氨酸树枝状聚合物慢。其次，在阴离子系列中，血浆清除率主要由树枝状聚合物的大小决定，而不是由表面电荷决定。然而，最终，表面电荷决定了肾脏的生物分布和清除模式，并且可能是由于苯磺酸盐与苯二磺酸盐树枝状聚合物的代谢敏感性不同所致。

不同保护的中间体和部分 PEG 结构的示例

示例 15*

BHALys [Lys] 的制备_8个[a-Boc]_8个[ε-NH2]_8个

一、BHALys[Lys]的制备_8个[α-Boc]s [ε-CBz]_8个

[0270]对于 BHALys [Lys] 的磁力搅拌溶液_4个[N.H_2个.TFA]_8个(1.59 mmol)、三乙胺 (4.50 mL, 32.30 mmol) 和 DMF (30 mL) 是 PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys (7.75 g, 15.45 mmol) 固体，在室温下加入一部分。反应悬浮液立即变成淡黄色，约 5 分钟后活性酯完全溶解。在室温下再搅拌 22 小时。将粗反应混合物倒入装有冰水的大烧杯中，形成细小的黄色沉淀。将悬浮液过滤并将保留的固体在抽吸下空气干燥过夜。将所得浅黄色干饼粉碎成细粉并在乙腈中重新浆化。将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后过滤。将保留的固体重新风干、重新喷雾并重新悬浮在乙腈中，然后过滤和风干过夜，得到 BHALys [Lys]。_8个[a-Boc]_8个[e-CBz]_8个t (5.52 g, 87%)，为无色固体。

[0271]LC/MS（phobic/TFA）：ESI (+ve) 观察到 [M+H/3] + m/z = 1328；计算 C207H305N31O47 3979.9； Rf（分钟）= 20.22 分钟。

二. BHALys [Lys] 的制备_8个[α-Boc]s [ε-NH_2个]_8个

[0273]LC/MS（亲水性/TFA）：ESI (+ve) m/z = 969.83 [M+3H]/3+，727.67 [M+4H]/4+，582.39 [M+5H] /5+；计算值 (C143H257N31O31) 2906.8 g/mol。使用转换计算展开的数据给出 mw = 2906.5。 Rf（平均值）= 14.7。

示例 16*

BHALys [Lys] 的制备_8个[α-NH_2个.TFA]_8个[e-CBz]_8个

[0274]BHAlys [卢兹]_8个[a-Boc]_8个[e-CBz]_8个将 (1000 mg, 0.251 mmol) 悬浮于乙酸 (5.5 mL) 中并在 0 °C 下搅拌，同时滴加三氟乙酸 (5.5 mL)。使反应混合物温热至室温并搅拌17小时，之后将反应混合物在乙醚中研磨。将所得悬浮液搅拌10分钟并通过离心和倾析除去液体。剩余的沉淀物用乙醚搅拌 10 分钟洗涤，然后通过离心和倾析除去沉淀物，然后将沉淀物真空干燥，溶于水并冻干，得到 BHALys [Lys]。_8个[α-NH_2个.TFA]_8个[e-CBz]_8个白色粉末（840 毫克，105%）。

例 17*

BHALys [Lys] 的制备_十六[a-Boc]_十六[ε-NH_2个]_十六

一、BHALys[Lys]的制备_十六[a-Boc]_十六[e-CBz]_十六

【0276】对于 BHAlys [Lys] 的搅拌溶液_8个[N.H_2个.TFA]_十六(0.81 mmol)、三乙胺 (4.50 mL, 32.30 mmol) 和 DMF (30 mL) 是 PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys (7.94 g, 15.83 mmol) 固体，在室温下加入一部分。反应悬浮液立即变成淡黄色，约 5 分钟后活性酯完全溶解。在室温下再搅拌 22 小时。将粗反应混合物倒入装有冰水的大烧杯中，形成细小的黄色沉淀。将悬浮液过滤并将保留的固体在抽吸下空气干燥过夜。将所得浅黄色干饼粉碎成细粉并在乙腈中重新浆化。将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后过滤。将保留的固体风干过夜，得到 BHALys [Lys]。_十六[a-Boc]_十六[e-CBz]_十六(5.79 g, 91%)，为无色固体。

[0277]LC/MS (Fóbico/TFA)：ESI (+ve) observado [M+H/4]+ m/z = 1977； [M + H/5] + m/z = 1582；计算 C407H609N63O95 7904.9; Rf (min) = 23,51 分钟。

二. BHALys [Lys] 的制备_十六[a-Boc]_十六[ε-NH_2个]_十六

[0278]BHALys[Lys] 的悬浮液_十六[a-Boc]_十六[e-CBz]_十六(50 mg, 0.006 mmol)、10% Pd/C (53 mg) 和乙酸 (2 mL) 在室温氢气下剧烈搅拌 16 小时。过滤黑色悬浮液。滤液浓度在吸尘器中产物 (26 mg, 71%) 为稻草色油状物。

例 18*

BHALys [Lys] 的制备_十六[α-NH_2个.TFA]_十六[e-CBz]_十六

[0280]BHAlys [卢兹]_十六[a-Boc]_十六[e-CBz]_十六将 (1000 mg, 0.127 mmol) 悬浮于乙酸 (5.5 mL) 中并在 0 °C 下搅拌，同时滴加三氟乙酸 (5.5 mL)。使反应混合物温热至室温并搅拌17小时。将反应混合物在乙醚(150mL)中研磨并将所得悬浮液搅拌10分钟。通过离心（4000 rpm，10 分钟）和倾析去除液体，剩余的沉淀物通过用乙醚（150 mL）振摇 10 分钟来洗涤，然后通过离心和倾析去除。真空干燥沉淀物，溶解在水 (50 mL) 中并冻干，得到 BHA Lys [Lys]。_十六[α-NH_2个.TFA]_十六[e-CBz]_十六白色粉末（832 毫克，114%）。

[0281]LC/MS（亲水/TFA）：ESI (+ve) m/z = 1576.85 [M+4H]/4+, 1261.34 [M+5H]/5+, 1051.27 [M+6H]; /6+, 901 , 15[M+7H]/7+;计算值 (C327H481N63O63) 6302.83 g/mol。使用转换计算展开的数据给出 mw = 6301.5。 Rf（平均值）= 19.0。

例 19*

BHALys [Lys] 的制备_8个[α-NH_2个]_8个[电子银行]_8个

一、BHALys[Lys]的制备_8个[a-CBz]s [e-BOC]_8个

【0283】LC/MS（phobic/TFA/Speedy Ramp）：ESI (+ve) 观察到 [M+H/3]+ m/z = 1328；计算 C207H305N31O47 3979.9； Rf（分钟）= 12.98 分钟

二. BHALys [Lys] 的制备_8个[α-NH_2个]_8个[电子银行]_8个

【0284】BHAlys [卢兹]_8个[a-CBz]s [e-Boc]_8个(5.0 mg, 1.26 µmol) 悬浮于 DMF/H 9:1_2个加入 O (2 mL)，在室温下搅拌，加入甲酸铵（2.5 mg，40.2 µmol），然后加入 Pd/C（10% w/w，2.7 mg）并淬火。晚上 8 点搅拌。通过滤除催化剂并用 9:1 DMF/H 洗涤过滤器来终止反应。_2个或（1 毫升）。真空浓缩滤液得到无色糖浆，用水(1ml)处理，真空除去糖浆，然后从水(1ml)中冷冻干燥得到BHALys[Lys]。_8个[α-NH_2个]_8个[电子书]_8个作为精细的白色冻干物（2 毫克，42%）。

[0285]LC/MS（亲水/TFA）：ESI (+ve) m/z = 969.88 [M+3H]/3+，727.56 [M+4H]/4+；计算值 (C143H257N31O31) 2906.8 g/mol。使用变换计算显示的数据给出 mw = 2906.5。 Rf（最小值）= 17.2。

示例 20*

BHALys [Lys] 的制备_8个[a-CBz]s [ε-NH_2个.TFA]_8个

【0286】BHAlys [卢兹]_8个[α-CBz]s [ε-Boc]_8个(20.0 mg, 0.005 mmol) 悬浮在乙酸 (109 µl) 中并在水浴中搅拌。小心加入三氟乙酸 (109 µl) 以溶解任何固体物质，并在室温下继续搅拌 16 小时。通过在真空中除去所有挥发物来淬灭反应，得到澄清、无色的油。该油状物在乙醚中研磨，所得白色沉淀物用乙醚洗涤并真空干燥，得到 BHALys [Lys]。_8个[α-CBz]s [ε-NH_2个.TFA]_8个(12.1 毫克，76%)，为白色固体。

示例 21*

BHALys [Lys] 的制备_十六[α-NH_2个]_十六[电子书]_十六

一、BHALys[Lys]的制备_十六[α-Fmoc]_十六[电子书]_十六

[0288]对于 BHAlys [Lys] 的搅拌溶液_8个[N.H_2个.TFA]_十六(0.54 mmol)、DIPEA (3.0 mL, 17.22 mmol) 和 DMF (11 mL) 是五氟苯氧基-α-Fmoc-ε-Boc-Lys (6.58 g, 10.36 mmol) 固体，在室温下加入一部分。反应悬浮液立即变成淡黄色，约 10 分钟后活性酯完全溶解。在室温下再搅拌18小时。这段时间之后，粗反应混合物变得如此粘稠以至于不能继续进行磁力搅拌。将乙腈（约 300 mL）添加到反应烧瓶中，并使用抹刀将固体打碎到足以允许继续搅拌（1 小时）。过滤悬浮液并使其在真空中风干过夜。将所得几乎无色的饼在研钵和研杵中研磨，细小的固体在乙腈(500ml)中重新浆化2小时。此后过滤悬浮液并收集无色固体并在室温下空气干燥过夜。获得所需产物，为灰白色固体（4.72 g，94%）。该产品被表征为未受保护的 Fmoc 衍生物 BHALys [Lys]。_十六α-NH_2个]_十六[电子书]_十六（见二）。

二. BHALys [Lys] 的制备_十六[α-NH_2个]_十六[电子银行]_十六

[0289]对于 BHALys [Lys] 的磁力搅拌悬浮液_十六[α-Fmoc]_十六[电子书]_十六在室温下，将纯哌啶 (1.0 g，0.108 mmol) (1.0 g，0.108 mmol) 和 DMF (10 mL) 以一份加入。将悬浮液再搅拌17小时，之后粗反应混合物变成浅黄色溶液。将混合物减压浓缩得到灰白色固体，然后将其在乙醚(加州. 100 毫升）。在室温下搅拌 30 分钟后，过滤浆液并让收集的固体风干过夜。获得呈无色固体状的所需产物（0.60 g，97%）。

示例 22*

BHALys [Lys] 的制备_十六[a-Boc]_十六[ε-NH_2个书]_十六

BHALys [Lys] 的制备_十六[a-Boc]_十六[ε-Fmoc]_十六和 BHALys [Lys] 的制造_十六[a-Boc]_十六[ε-Fmoc]_十六

【0291】混合 BHAlys [Lys]_十六[α-CBz]_十六[电子书]_十六(0.01 mmol) 和二氯甲烷 (0.5 ml) 在氮气下逐滴加入纯 TFA (0.5 ml)。在室温下继续搅拌18小时。除去反应的挥发性组分在吸尘器中所得胶状残余物用乙醚处理以诱导盐产物沉淀。过滤悬浮液并用乙醚洗涤收集的固体。将所得固体溶解在水中并通过冷冻干燥过夜浓缩至干。获得蓬松的无色固体产物。

[0292]LC/MS (Hidrofilico/TFA)：ESI (+ve) 观察 [M+H/4]+ m/z = 1577； [M+H/5]+ m/z = 1262 对 C327H481N63O63 6302,8 的计算

示例 23*

BHALys [Lys] 的制备_十六[α-CBz]_十六[ε-NH_2个.TFA]_十六

【0293】混合 BHAlys [Lys]_十六[α-CBz]_十六[电子书]_十六(0.01 mmol) 和二氯甲烷 (0.5 ml) 在氮气下逐滴加入纯 TFA (0.5 ml)。在室温下继续搅拌18小时。除去反应的挥发性组分在吸尘器中所得胶状残余物用乙醚处理以诱导盐产物沉淀。过滤悬浮液并用乙醚洗涤收集的固体。将所得固体溶解在水中并通过冷冻干燥过夜浓缩至干。获得蓬松的无色固体产物。

示例 24*

BHALys [Lys] 的制备_十六[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个[e,a-Boc]_8个[e,e-CBz]_8个

一、BHALys[Lys]的制备_8个[e-CBz]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六

[0295]将 DBL-OPNP（3.6 g，7.2 mmol）和三乙胺（2.1 ml，15 mmol）添加到 BHA Lys [Lys] 的搅拌溶液中。_8个[e-CBz]_8个[α-NH_2个.TFA]_8个(3g, 0.75mmol) 在 DMF (30ml) 中。将所得黄色溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物加入到搅拌的乙腈(300mL)中，从黄色溶液中产生白色沉淀。通过过滤收集该沉淀物并用乙腈洗涤以除去残留的有色物质。然后在室温下真空干燥沉淀物以提供 BHALys [Lys]。_8个[e-CBz]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六白色粉末（4.2 g，98%）。

【0296】LC/MS (Rápido Hidrofóbico/TFA)：Rf(min)= 13,70； ESI (+ve) m/z= 1936 ([M+3]/3), 1452 ([M+4]/4), 1062 ([M+5-Boc]/5);卡尔克。 C295H465N47O71。 M+1。 5083.4

二. BHALys [Lys] 的制备_8个[ε-NH_2个]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六

[0297]对于 BHAlys [Lys] 的搅拌溶液_8个[e-CBz]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六添加 (2.2 g, 0.38 mmol) 在乙酸 (30 mL) 中的溶液，加入 10% Pd/C (101 mg, 0.095 mmol)。将所得均匀混合物在室温下在氢气下放置 16 小时。过滤溶液并真空浓缩。将所得粘性残留物重新溶解在水中并冻干，得到 BHALys [Lys]。_8个[ε-NH_2个]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六(1.97 g, 0.38 mmol) 含有一些残留的乙酸。

[0298]LC/MS（Hidrofilico/TFA）：Rf（分钟）= 18,53； ESI (+ve) m/z = 1184 ([M+4]/4), 947 ([M+5]/5), 790 ([M+6]/6);卡尔克。 C231H417N47O55。 M+1。 4731.1

三. BHALys [Lys] 的制备_十六[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个[e,a-Boc]_8个[e,e-CBZ]_8个

[0300]LC/MS（Fobico TFA Speedy Rp）：Rf（最小值）= 14,32； ESI (+ve) m/z= 2544 ([M+3]/3), 1909 ([M+4]/4), 1527 ([M+5]/5);卡尔克。 C383H625N63O95。 M+1。 7629

示例 25*

BHALys [Lys] 的制备_十六[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个[e,a-Boc]_8个[ε,ε-Fmoc]_8个

[0301]将 PFP-Lys-α-Boc-ε-Fmoc（96 毫克，0.15 毫摩尔）和三乙胺（0.04 毫升，0.27 毫摩尔）添加到 BHALys[Lys] 的搅拌溶液中。_8个[ε-NH_2个]_8个[α-Lis]_8个[书]_十六（100 毫克，0.017 毫摩尔）在 DMF（10 毫升）中。将该溶液在室温下搅拌16小时。然后将反应混合物加入到乙腈(100mL)中，产生透明凝胶状沉淀物。过滤收集该沉淀物并用乙腈洗涤。将沉淀物在室温下干燥以提供 BHALys [Lys]。_十六[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个[e,a-Boc]_8个[ε,ε-Fmoc]_8个(30 毫克, 21 %)

[0302]LC/MS（Hidrofóbico/TFA）：Rf（分钟）= 7,72； ESI (+ve) m/z = 1667 ([M+5]/5), 1389 ([M+6]/6), 1191([M+7]/7);卡尔克。 C439H657N63O95。 M+1 8332

定义的 PEG 制剂 1.7KD

示例 26*

BHALys [Lys] 的制备_8个(α-NH_2个.TFA)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个

一、BHALys[Lys]的制备_8个(a-Boc)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个

[0304]对于 BHAlys [Lys] 的搅拌溶液_8个(a-Boc)_8个(ε-NH_2个.TFA)_8个(9.2 mg, 0.003 mmol) 在干燥的 DMF (1 mL) 和 DMSO (1 mL) 中，在氮气下加入 NHS-PEG 685.75 (26 mg, 0.45 mmol) 和三乙胺 (10 µL, 0.108 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后减压浓缩得到粗制油状物，将其通过制备纯化进行纯化。 HPLC [C18 制备。色谱柱：Waters Xterra Prep RP18，10 µm，19 x 250 mm。室内温度。梯度：10-45% MeCN 超过 80 分钟。 Rf（分钟）85]。给 BHALys [Lys]。_8个(a-Boc)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个透明油状物（18 毫克，75%）

[0305]LC-MS：（Fóbico，TFA）Rf（最小值）12,81。 ESI (+ve) m/z = 1246,3 (M/6), 1068,2 (M/7), 934,8 (M/8) 831,2 (M/9)。

二. BHALys [Lys] 的制备_8个(α-NH_2个.TFA)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个

【0306】对于 BHAlys [Lys] 的搅拌溶液_8个(a-Boc)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个(18 mg, 0,002 mmol) en CH_2个钾_2个在 0 °C 下将 HCl (3 mL) 添加到 TFA (45 μL，0.58 mmol) 中，在 0 °C 下继续搅拌 20 分钟，然后在室温下搅拌 2 小时。减压除去溶剂，得到 BHALys [Lys]。_8个(α-NH_2个.TFA)_8个(e-聚乙二醇₅₇₁)_8个作为油（16 毫克，88%）

[0307]LC-MS：（Filico，TFA）Rf（分钟）10,36。 ESI (+ve) m/z = 954 (M/7)、834 (M/8)、742 (M/9)。

例 27

BHALys [Lys] 的制备_十六[e-聚乙二醇₅₇₀]_十六[e-MTX]_十六

[0309]密码更换₁₇₁₆， 联系₂₆₄₅和插头₃₉₇₄确保₅₇₀-NHS 提供树状聚体结构，PEG 的大小不断增加，并且需要替代反应条件，其中 3f 结构具有过量的 PEG_兆瓦-一氧化碳_2个H、HOBt 和 EDC 在 DMF 中与 DIPEA 一起获得结构 3g (R_1个= 密码_兆瓦R_2个= CBz) BHALis [Lis]_十六[α-聚乙二醇_兆瓦]_十六[e-CBz]_十六

例 28

BHALys [Lys] 的制备_十六[α-聚乙二醇₅₇₀]_十六[e-COCH_2个CH_2个紫杉醇]_十六.

[0310]参考反应方案 5 (图 18).反应方案如下： BHALys [Lys]_十六[α-聚乙二醇₅₇₀]_十六[ε-NH_2个]_十六, 结构 3h (R_1个= 密码₅₇₀, R_2个= H) 与 TFA（16 当量）与过量的 H2O 反应_2个CCH_2个CH_2个CO 紫杉醇、EDC、HOBt 和 DIPEA en DMF 和 BHALys [Lys]_十六[α-聚乙二醇₅₇₀]_十六[e-COCH_2个CH_2个紫杉醇]_十六, 结构 3 l (R_1个= 密码₅₇₀, R_2个= 旋转_2个CH_2个CO-紫杉醇）。

[0311]密码更换₁₇₁₆， 联系₂₆₄₅和插头₃₉₇₄确保₅₇₀在结构 3h 中提供了具有增加的 PEG 大小的树枝状聚合物结构。

例 29

BHALys [Lys] 的制备_十六[ε,ε-聚乙二醇₅₇₀]_8个[腐败_2个CH_2个紫杉醇]₂₄

一、BHALys[Lys]的制备_8个[α-NH_2个]_8个[e-CBz]_8个

二. BHALys [Lys] 的制备_十六[ε,ε-聚乙二醇₅₇₀]_8个[腐败_2个CH_2个紫杉醇]₂₄

【0313】参考反应方案 6（第 2 部分）描述了标题化合物的制备（图 19B).反应方案如下： BHALys [Lys]_8个[α-NH_2个]_8个[e-CBz]_8个, 结构 5b (R_1个= FC_2个= CBz) 与 TFA（8 当量）以及 DMF 中过量的 DBL-OPNP 和 DIPEA，以提供 BHALys [Lys]。_8个[e-CBz]_8个[lis]_8个[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个, 结构 6a (R_1个=中银R_2个=CBz);结构 6a 与 H 反应_2个和 Pd (10%) 在乙酸中的碳上，然后形成离子交换树脂 (OH-) 得到 BHALys [Lys]。_8个[ε-NH_2个]_8个[lis]_8个[a,a-Boc]_8个[a,e-Boc]_8个, 结构 6b (R_1个=中银R_2个=H);结构 6b 与含有过量 PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys 和 DIPEA 的 TFA（8 当量）在 DMF 中反应，得到 BHALys [Lys]。_十六[e,e-CBZ]_8个[书]₂₄, 结构 7a (R_1个=中银R_2个= CBz);结构 7a 与 H 反应_2个和 Pd (10%) 在乙酸中的碳上，然后离子交换树脂 (OH-) 得到 BHALys [Lys]。_十六[ε,ε-NH_2个]_8个[书]₂₄, 结构 7b (R_1个=中银R_2个=H);结构 7b 与过量 PEG 反应₅₇₀-含有 DIPEA 的 DMF 中的 NHS 可提供 BHALys [Lys]。_十六[ε,ε-聚乙二醇₅₇₀]_8个[书]₂₄, 结构 7c (R_1个=中银R_2个= 密码₅₇₀);结构 7c 与 TFA 反应生成 BHALys [Lys]。_十六[ε,ε-聚乙二醇₅₇₀]_8个[N.H_2个.TFA]₂₄, 结构 7d (R_1个= H.TFA R_2个= 密码₅₇₀);结构 7d I 与过量的 H2O 反应_2个CCH_2个CH_2个CO 紫杉醇、EDC、HOBt 和 DIPEA en DMF 和 BHALys [Lys]_十六[ε,ε-聚乙二醇₅₇₀]_8个[腐败_2个CH_2个紫杉醇]₂₄, 结构 7e (R_1个= 旋转_2个CH_2个紫杉醇R_2个= 密码₅₇₀).

示例 30*

定义的 PEG 级分的制备：PEG₁₇₁₆， 联系₂₆₄₅， 联系₃₉₇₄.

[0315]反应方案 7 (图 20).反应方案如下： i．何_2个聚乙二醇₁₁₄₆-N.H_2个与 PEG 反应₅₇₀-DMF 缓冲液 pH 8.5 中的 NHS 可提供 PEG₁₇₁₆-一氧化碳_2个H;二.联系₁₇₁₆-一氧化碳_2个H 是通过 DCC 和 NHS 实现的，所以 HO_2个聚乙二醇₁₁₄₆-NH2 溶于 pH 8.5 的 DMF 缓冲液，得到 PEG₂₈₄₅-一氧化碳_2个H;三.联系₂₈₄₅-一氧化碳_2个H 是通过 DCC 和 NHS 实现的，所以 HO_2个聚乙二醇₁₁₄₆-N.H_2个在 DMF 缓冲液 pH 8.5 中得到 PEG₃₉₇₄-一氧化碳_2个H

示例 31*

BHALys [Lys] 的制备_2个[苏（NPN）_2个]_4个[α-tBu-MTX]_4个[关联₅₇₀]_4个

一、N-(苄氧基羰基)-3-溴丙胺的制备

[0316]

[0051]

[0317]将 TEA (6.91 g, 68.5 mmol) 滴加到 3-溴丙胺氢溴酸盐 (10.0 g, 45.6 mmol) 和 N-(苄氧基羰基氧基)-琥珀酰亚胺 (11 0.22 g, 47.9 mmol) 在 DCM (200 mL) 中的冰冷混合物中).将搅拌的混合物升温至室温过夜，然后用水 (3x)、盐水洗涤，干燥 (MgSO 4 )，过滤并浓缩，得到 11.43 g (92%) N-(苄氧基羰基)-3-溴丙胺as，得到淡黄色油状物。

二.做 [BOC][Cbz][NPN]_2个

[0318]

[0052]

三.做 [BOC][Cbz][NPN]_2个硫酸盐

[0320]

[0053]

[0321]对于 [BOC][Cbz][NPN] 的搅拌混合物_2个在室温下向 (6.55 g, 17.9 mmol) 的甲苯 (60 mL) 中添加琥珀酸酐 (1.79 g, 17.9 mmol)。将混合物在70℃加热一小时，然后浓缩。然后将残余物溶解在 EA/乙醚 (5:1) 中并用 NaOH (1.0M, 2 x 100ml) 洗涤。然后用乙醚洗涤碱性洗液，然后中和(HCl，1.0M，2×100mL)。然后将水性混合物用 EA (3 x 250 mL) 洗涤、干燥 (MgSO4)、过滤并浓缩，得到 6.97 g (84%) [BOC][Cbz][NPN]。_2个SuOH为无色粘稠油状物。

4. [BOC][Cbz][NPN]的制作_2个SuOPNP

[0322]

[0054]

五。做 [BOC][Cbz][NPN]_2个好的

[0324]

[0055]

[0325][BOC][Cbz][NPN] 的搅拌混合物_2个将 EtOH (100 mL) 中的 SuOPNP（1.16 g，1.98 mmol）和 TEA（2.0 mL，14.4 mmol）在 70 °C 下加热 2 天，浓缩，然后溶解在乙酸钠.乙基（120 ml）中。然后用K洗_2个一氧化碳_3个溶液 (5%, 4 × 200 mL)，盐水，干燥 (MgSO_4个), 过滤并浓缩，得到 0.87 g (90%) [BOC][Cbz][NPN]。_2个SuOEt为无色粘稠油状物。

[0326]LCMS（LC：Filico，Formiat，RT = 9.3 分钟；MS（M_足球。C₂₅H₃₉北方_3个o₇= 493.61): 511 ([M + 小_4个]⁺, 13%), 494([M+H]⁺, 100%), 438 ([M -吨-Bu + H]⁺, 15 %), 394 ([M - BOC + H]⁺, 13%)。

见过。 [BOC][NH的制备_2个][NPN]_2个好的

[0328]

[0056]

[0329]对于 [BOC][Cbz][NPN] 的搅拌混合物_2个SuOEt（0.88 g，1.77 mmol）和 DMF/H_2个将 O (9:1, 20 mL) 添加到甲酸铵 (224 mg, 3.55 mmol) 和 Pd/C (10%, 470 mg) 中。将混合物在室温下搅拌 2 小时，然后过滤（0.2 µm PALL 滤盘）并浓缩。将残余物吸收在水中并浓缩(2x)。用 MeOH 和 DCM 重复此操作，得到 0.54 g (84%) [BOC][NH]。_2个][NPN]_2个SuOEt 为透明无色油状物。

[0330]LCMS (LC: fílica, TFA, RT = 6,2 min; MS (M_计算C₁₇H₃₃北方_3个o_5个= 359,47): 360([M + A]⁺, 100%).

[0331]^1个H (CDCl_3个): δ 5,30 (br s, 1H), 4,80 (br s, 1H), 4,12 (q, J = 9,0 Hz, 2H), 3,29-3,46 (m, 4H ), 3,14 (男, 1H), 3,07 (男, 1H), 2,56-2,80 (男, 6H), 1,60-1,90 (男, 4H), 1,42, 1,43 (2s, 9H), 1,25 (吨, J = 9.0 赫兹, 3H)。

七. [BOC][PEG 的制备₅₇₀][NPN]_2个好的

[0332]

[0057]

【0334】LCMS (LC: fílica, TFA, RT = 8,2 min; MS (M_计算C₄₃H₈₃北方_3个o₁₈= 930.15): 948([M + 小_4个]⁺, 12%), 931([M+H]⁺, 2%), 416(1/2[M – BOC + 2H⁺], 100%).

[0335]^1个H (CDCl_3个): δ 7,10 (br s, 1H), 7,03 (br s, 1H), 4,16 (q, J = 9,0 Hz, 2H), 3,72 (m, 2H), 3, 58-3,66（米，36H），3,52-3,56（米，2H），3,47（秒，2H），2,96-3,42（米，7H），3,37（ s, 4H), 2,70 (s, 4H), 2,60 (m, 4H), 2,47 (m, 2H), 1,60-1,90 (m,4H), 1,41,1 ,43 (2s, 9H), 1,24 (吨, J = 9.0 赫兹, 3H)。

八。 [NH_2个.TFA][聚乙二醇₅₇₀][NPN]_2个好的

【0336】

[0058]

【0337】对于 [BOC][PEG 的搅拌混合物₅₇₀][NPN]_2个将 TFA (0.50 mL) 添加到 SuOEt (180 mg, 0.19 mmol) 的 DCM (2 mL) 溶液中。将混合物在室温下搅拌6小时，浓缩，H_2个这增加和减少了 (2x)。然后将残留物溶解在 H_2个或者再次 (20 mL)，过滤（0.2 µm PALL 滤盘），然后冻干，得到 0.17 g (93%) [NH_2个.TFA][聚乙二醇₅₇₀][NPN]_2个SuOEt 为透明无色油状物。

【0338】LCMS (LC: fílica, TFA, RT = 5,9 min; MS (M_计算C₃₈H₇₅北方_3个o_十六= 830,03): 831 ([M + H]⁺, 7%), 425 (1/2[M + Na⁺+H⁺], 30%), 416(1/2[M + 2H⁺], 100%).

[0339]^1个高清_2个O): δ 4.17 (q, J = 9.0 Hz, 2H), 3.80 (吨, J = 6,0 Hz, 2H), 3,62-3,75 (m, 43H), 3,38-3,53 (m, 4H), 3,40 (s, 3H), 2,90- 3,31（米，4H），2,77（米，4H），2,64-2,89（米，4H），2,52-2,58（米，2H），1,72-2， 11 (m, 4H), 1,13 (t, J = 9,0 Hz, 3H)。

九。 [α-tBu-MTX][PEG 的制备₁₅₇₀][NPN]_2个好的

[0340]

[0059]

[0342]LCMS (LC: fílica, TFA, RT = 8,0 min; MS (M_计算C₆₂H₁₀₃北方₁₁o₂₀= 1322,57): 1323([M + H]⁺, 2%), 662 (1/2[M + 2H⁺], 17%), 634(1/2[M-tBu + 2H⁺], 82 %).

X. [α-tBu-MTX][PEG 的制备₅₇₀][NPN]_2个硫酸盐

【0343】

[0060]

【0344】[α-tBu-MTX][PEG1 的搅拌混合物₅₇₆][NPN]_2个SuOEt (109 mg, 82,4 µmol) 和 THF/H_2个添加 NaOH O (2:1, 9 mL) (0.16 mL, 1.0 M)。反应在室温下搅拌 16 小时，必要时加入更多的 NaOH（反应记号）。反应完成后，用 HCl (1.0 M) 将 pH 值调至中性。然后除去溶剂，将残余物吸收在MeOH中并过滤以除去盐。然后通过 PTLC（18% MeOH，82% DCM，Rf = 0.4）纯化残余物，得到 52 mg（49%）[α-tBu-MTX][PEG]。₅₇₆][NPN]_2个SuOH 像橙油。

【0345】LCMS (LC: fílica, TFA, RT = 6,8 min; MS (M_计算C₆₀H₉₉北方₁₁o₂₀= 1294,52): 1317([M + Na]⁺, 3%), 1295 ([M+H]⁺, 2%), 648 (1/2[M + 2H⁺], 10%), 620(1/2[M-tBu + 2H⁺], 74 %), 419 (100 %)。

十一. BHALys [Lys] 的制备_2个[苏（NPN）_2个]_4个[α-tBu-MTX]_4个[关联₅₇₀]_4个

【0347】LCMS（LC：二氧化硅，TFA，RT = 8,0 分钟；MS：1136（1/5[M + 5H⁺], 18%), 946 (1/6[M + 6H⁺], 100%), 812(1/7[M + 7H⁺], 22%) 变为 5,673.34。 （仪表_计算C₂₇₁H₄₃₇北方₅₁o₇₉= 5.673,80)。

示例 32*

BHALys [Lys] 的制备_4个[苏（NPN）_2个]_8个[α-tBu-MTX]_8个[关联₅₇₀]_8个

[0349]LCMS（LC：二氧化硅，TFA，RT = 9,0 分钟；MS：1614（1/7[M + 7H⁺], 26%), 1413(1/8[M + 8H⁺], 73 %), 1256 (1/9 [M + 9H⁺], 100%) 转换为 11,294.54。 （仪表_计算C₅₃₅H₈₇₃北方₁₀₃o₁₅₉= 11.292,52)。

示例 33*

BHALys [Lys] 的制备_8个[苏（NPN）_2个]_十六[α-tBu-MTX]_十六[关联₅₇₀]_十六

[0350]BHALys [光]-反应_8个[N.H_2个.TFA]_十六com [α-tBu-MTX][PEG₅₇₆][NPN]_2个SuOH 使用类似于实施例 31 中描述的程序得到 BHALys [Lys]_8个[苏（NPN）_2个]_十六[α-tBu-MTX]_十六[关联₅₇₀]_十六(6 mg) (46 %) PREP HPLC（5-60 % ACN，90 分钟，RT 66 分钟）。

[0351]LCMS（LC：二氧化硅，TFA，RT = 9,0 分钟；MS：2254（1/10[M + 10H⁺], 24%), 2049(1/11[M + 11H⁺], 56%), 1879(1/12[M + 12H⁺], 100%), 1734(1/13[M + 13H⁺], 55%) 变成22,531.91 (M_计算C₁₀₆₃H₁₇₄₅北方₂₀₇o₃₁₉= 22.529,73）。

示例 34*

BHAlys [卢兹]_十六[苏（NPN）_2个]₃₂[α-tBu-MTX]₃₂[关联₅₇₀]₃₂

【0353】BHALys [光]-反应_十六[N.H_2个.TFA]₃₂com [α-tBu-MTX][PEG₅₇₆][NPN]_2个SuOH 使用类似于实施例 31 中描述的程序得到 BHALys [Lys]_十六[苏（NPN）_2个]₃₂[α-tBu-MTX]₃₂[关联₅₇₀]₃₂(7 mg) (44 %) PREP HPLC（5-60 % ACN，90 分钟，RT 71 分钟）。 LCMS（LC：fílica，TFA，RT = 9.2 分钟；MS：（M_计算C₂₁₁₉H₃₄₈₉北方₄₁₅o₆₃₉= 45.004,27)

示例 35*

一、[BOC][PEG的制备₁₁₀₀][NPN]_2个好的

【0354】

[0061]

[0355]对于 [BOC][NH 的搅拌混合物_2个][NPN]_2个将 DMF (2 mL) 中的 SuOEt 添加到 TEA (2 eq) 和 PEG 中₁₁₀₀NHS（1 当量）作为 DMF/DCM 溶液（2 mL）。将混合物在室温下搅拌，浓缩，然后通过 FCC 纯化，得到 [BOC][PEG]。₁₁₀₀][NPN]_2个SuOEt 为透明无色油状物。

二. [NH2.TFA][PEG]的制备₁₁₀₀][NPN]_2个好的

【0356】

[0062]

三. [α-tBu-MTX][PEG 的制备₁₁₀₀][NPN]_2个好的

【0358】

[0063]

4. [α-tBu-MTX][PEG 的制备₁₁₀₀][NPN]_2个硫酸盐

[0360]

[0064]

【0361】[α-tBu-MTX][PEG1 的搅拌混合物₁₁₀₀][NPN]_2个SuOEt en THF/H_2个加入 NaOH 0 (2:1, 9 mL) (2 eq., 1.0 M)。使反应在室温下搅拌16h，如果需要则加入更多的NaOH(通过TLC评估反应)。反应完成后，用 HCl (1.0 M) 将 pH 值调至中性。然后除去溶剂，将残余物吸收在MeOH中并过滤以除去盐。然后通过 PTLC [α-tBu-MTX][PEG] 纯化残留物。₁₁₀₀][NPN]_2个SuOH 像橙油。

五。 BHALys [Lys] 的制备_8个[苏（NPN）_2个]_十六[α-tBu-MTX]_十六[关联₁₁₀₀]_十六

示例 36*

Hacer HOGlyLight [浅色]_2个[书]_3个[e,e-CBz]

【0363】合成示意性地显示在图 21.

一、MeOGlyLys[α-Boc][ε-CBz]的制备。

【0364】将 PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys（50.15 g，0.100 mol）添加到搅拌的甘氨酸甲酯盐酸盐（12.56 g，0.110 mol）在三乙胺（30.36 g，0.300 mol）和二甲基甲酰胺（ 200 毫升）。在室温下搅拌16小时后，蒸发挥发物。在吸尘器中残余物在乙酸乙酯（200毫升）和5%碳酸钠水溶液（175毫升）之间分配。弃去水相，乙酸乙酯相依次用 5% 碳酸钠水溶液 (4 x 200 mL)、0.25 M 盐酸 (2 x 50 mL) 和饱和氯化钠水溶液 (50 ml) 洗涤。将乙酸乙酯溶液干燥（硫酸镁），过滤并蒸发溶剂。在吸尘器中制备的 MeOGlyLys [α-Boc] [ε-CBz]（44.39 g，98%）为无色油状物。

【0365】^1个RMN-H (300 兆赫, CD_3个DO) δ (ppm): 1,3-1,8 (m, 6H); 1,44 (s, 9H); 3.13（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3,70 (s, 3H); 3,88 (天,j17.7 赫兹，1 小时）； 3,99 (天,j17.7 赫兹，1 小时）； 4,04（米，1H）； 5,06 (s, 2H); 7,2-7,4（米，5H）。

【0366】LC/MS（疏水性/格式）：ESI (+ve) beobachtet [M + H]⁺m/z = 452.0;为 C 计算₂₂H₃₄北方_3个o₇452.2。 Rf（最小值）= 5.2。

二. MeOGlyLys [α-NH_2个.TFA] [ε-CBz]

【0368】^1个RMN-H (300 兆赫, CD_3个DO) δ (ppm): 1,5-1,6 (m, 4H); 1,8-2,0（米，2H）； 1,44 (s, 9H); 3,15 (t, J 6,8 赫兹, 2H); 3,71 (s, 3H); 3,88（吨，j6.4 赫兹，1 小时）； 3,94 (天,j17.6 赫兹，1 小时）； 4.08 (d,j17.6 赫兹，1 小时）； 5,07 (s, 2H); 7,2-7,4（米，5H）。

【0369】LC/MS（亲水性/甲型）：ESI (+ve) bebechtert [M + H]⁺m/z = 352.1;为 C 计算₁₇H₂₆北方_3个o_5个352.2。 Rf（最小值）= 12.3。

三. MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc] 的制备。_2个

[0370]将 DBL-OPNP (49.37 g, 0.106 mol) 添加到搅拌的 MeOGlyLys[α-NH_2个.TFA][ε-CBz]（46.0 g，96.0 mmol）和三乙胺（24.3 g，0.240 mol）在二甲基甲酰胺（200 mL）中的溶液。在室温搅拌17h后，加入甘氨酸(3.98g，53.0mmol)在水(50ml)中的溶液并将浑浊溶液搅拌24h。向充分搅拌的混合物中加入水(150mL)，白色固体开始沉淀。然后加入片冰(200g)并继续搅拌直至冰融化。过滤收集固体，在 5% 碳酸钠水溶液中浆化并超声处理 0.5 小时，抽吸半干燥，然后用更多 5% 碳酸钠水溶液 (2 × 200 mL) 洗涤，然后用水 (3 × 200 ml) ). .然后将浅黄色固体在另外的200mL 5%碳酸钠水溶液中搅拌并过滤得到浅黄色粉末。固体用水(2×200ml)洗涤，然后在更多的水(200ml)中浆化并超声处理1.5小时。过滤和吸干然后真空干燥得到61.0g棕色粉末。从乙酸乙酯中重结晶得到 MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]_2个(50.05 g, 77%)，为白色固体。

[0372]LC/MS（亲水性/甲型）：ESI (+ve) bebechtert [M + H]⁺m/z = 680.0;为 C 计算₃₃H₅₄北方_5个o₁₀680.4；观察到 [M + NH_4个]⁺m/z = 697.0;为 C 计算₃₃H₅₇北方_6个o₁₀697.4。 Rf（最小值）= 8.0。

4. MeOGlyLys 的制备 [ε-NH_2个.TFA] [α-Lys] [Boc]_2个

【0373】MeOGlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc] 的溶液。_2个(680 mg, 1.00 mmol) 和三氟乙酸 (77 µl, 1.0 mmol) 在甲醇 (10 ml) 中的溶液添加到 10% w/w 钯碳悬浮液 (106 mg, 0.10 mmol P.S)。压力。将混合物在室温下搅拌1小时，然后通过硅藻土垫过滤。甲醇被蒸发在吸尘器中将残余物重新溶解在甲醇（5 毫升）中，溶液通过 0.2 微米的过滤器。甲醇蒸发在吸尘器中剂量 MeOGlyLys [ε-NH_2个.TFA] [α-Lys] [Boc]_2个（640 毫克，97%）为易碎的白色泡沫。

【0374】^1个RMN-H (300 兆赫, CD_3个DO) δ (ppm): 1,2-2,0 (m, 30H); 2,93（吨，j7.5 赫兹，2 小时）； 3,03（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3,72 (s, 3H); 3,89（天，j17.7 赫兹，1 小时）； 3,98 (日,j5,4, 9,0 赫兹, 1H); 4.02 (d,j17.7 赫兹，1 小时）； 4,42 (日,j5,7, 8,4Hz, 1H)。

【0375】LC/MS（亲水性/甲型）：ESI (+ve) bebechtert [M + H]⁺m/z = 546.2;为 C 计算₂₅H_48岁北方_5个o_8个546.3。 Rf（最小值）= 14.2。

五。 MeOGlyLys[Lys]2[Boc]3[ε,ε-CBz] 的制备

【0377】^1个RMN-H (300 兆赫, CD_3个DO) δ (ppm): 1,2-2,0 (m, 45H); 3,03（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3.12（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3,19（米，2H）； 3,71 (s, 3H); 3,88 (天,j17.4 赫兹，1 小时）； 3,93-4,06（米，2H）； 4,00 (日,j17.7 赫兹，1 小时）； 4.38 (dd,j5,4, 8,4Hz, 1H); 5,07 (s, 2H); 7,25-7,45（米，5H）。

【0378】LC/MS（疏水性/格式）：ESI (+ve) beobachtet [M + H]⁺m/z = 908.4;为 C 计算₄₄H₇₄北方₇o₁₃908.5；观察到 [M + NH_4个]⁺m/z = 925.4;为 C 计算₄₄H₇₇北方_8个o₁₃925.5。 Rf（最小值）= 9.5。

见过。制作 HOGlyLys [Lys]_2个[书]_3个[e,e-CBz]

【0379】MeOGlyLight [浅色]_2个[书]_3个[ε,ε-CBz]（500 mg，0.55 mmol）溶解在氢氧化钠（44 mg，1.10 mmol）的甲醇（8 mL）和水（4 mL）溶液中。将溶液在室温下搅拌4小时并蒸发溶剂。在真空中。将残余物溶解在水(10ml)中并加入1M硫酸氢钾(2ml)。将所得白色沉淀物萃取到乙酸乙酯(10ml)中并弃去水相。乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液(10ml)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并蒸发溶剂。在吸尘器中更多 HOGlyLys [赖氨酸]_2个[书]_3个[ε,ε-CBz]（481 毫克，96%），为白色无定形固体。

[0380]^1个RMN-H (300 兆赫, CD_3个DO) δ (ppm): 1,2-2,0 (m, 45H); 3,03（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3.12（吨，j6.6赫兹，2小时）； 3,19（米，2H）； 3,84 (天,j18,0Hz, 1H); 3,95-4,07（米，2H）； 3,97 (天,j17.7 赫兹，1 小时）； 4.39 (dd,j5,4, 8,4Hz, 1H); 5,07 (s, 2H); 7,25-7,38（米，5H）。

【0381】LC/MS (hidrofóbico/TFA)：ESI (+ve) beobachtet [M + H]⁺m/z = 894.3;为 C 计算₄₃H₇₂北方₇o₁₃894.5。 Rf（最小值）= 8.4。

示例 37*

BHALys [GlyLys] 的制备_2个[lis]_4个[书]_6个[e,e-CBz]_2个（C₁₀₅H₁₆₃北方₁₇o₂₅兆瓦 2063,5)

【0382】合成示意性地显示在图 22.

【0383】将 EDCI (0.90 mmol) 添加到 HOGlyLys [Lys] 的溶液中。_2个[书]_3个[ε,ε-CBz]（536 毫克，0.60 毫摩尔），BHALys [NH_2个.TFA]_2个(135 mg, 0.250 mmol)、4,4-二甲氨基吡啶 (7.3 mg, 60 μmol) 和三乙胺 (210 μL, 1.50 mmol) 的二甲基甲酰胺 (10 mL)。将溶液在室温下搅拌15小时，然后除去挥发物。在真空中。硅胶色谱法（甲醇/二氯甲烷梯度）得到 BHAlys [GlyLys]_2个[lis]_4个[书]_6个[e,e-CBz]_2个（245 毫克，47%）。以常规方式用乙酸/TFA 处理少量样品 (20 mg) 以提供分析数据。

【0384】LC/MS（philic/TFA）：ESI (+ve) 观察 [M+H]⁺m/z = 1463.2;为 C 计算₇₅H₁₁₆北方₁₇o₁₃1462,9。

示例 38*

BHALys [Lys] 的制备_十六[α-聚乙二醇₅₇₀]_十六[腐败_3个]_十六

示例 39*

树枝状聚合物的淋巴定向：

【0387】这项研究的结果表明，高达 40% 的皮下剂量的聚乙二醇化聚赖氨酸树枝状聚合物可以在剂量注射后 48 小时内被吸收到淋巴中（图 23).这取决于树枝状聚合物的大小，其中 38.5 ± 0.7%（平均值 ± SD，n=3）是 Lys_十六（联系₂₀₀₀)₃₂(68 kDa) 在 48 小时内被淋巴吸收，28.8 ± 6.6% Lys_十六（联系₅₇₀)₃₂(22 kDa) 在 30 小时内在淋巴中被回收，而只有 3.8% (n = 1) 的 Lys_十六（联系₂₀₀)₃₂(11 kDa) 在乳腺淋巴中回收。聚乙二醇化有助于增加树枝状聚合物吸收到淋巴中，因为在 30 小时内只有 1.7 ± 1.5%（平均值±标准差，n = 3）的非聚乙二醇化苯磺酸盐树枝状聚合物（11 kDa）被吸收到淋巴中（平均值±标准差）。偏差，n=3)。约 0.3% 的 Lys 剂量_十六（联系₅₇₀)₃₂赖氨酸_十六（联系₂₀₀₀)₃₂在处死时从右腘窝节点和髂淋巴结集中收集树枝状聚合物。这对应于大约 2-3% 剂量/g 淋巴结恢复，这明显高于通常在 IV 剂量后 30-168 小时在淋巴结中发现的放射性示踪剂浓度（高达 1. 5% 剂量/g 组织）。主要器官再次定位。

【0388】总之，在皮下给药后，大量较大的聚乙二醇化树枝状聚合物（>20 kDa）被吸收到区域淋巴管中，而在淋巴中回收了少量的较小（11 kDa）聚乙二醇化或非聚乙二醇化树枝状聚合物。在非聚乙二醇化材料的情况下，这可能也反映了注射部位的引流减少。皮下给药后 30-48 小时，在区域淋巴结中回收了一小部分剂量，尽管这表示由于它们的低质量（大约 0.1-0.2 g），淋巴结中树状聚合物的浓度相对较高。具有较大 PEG 簇的 PLL 树枝状聚合物的聚乙二醇化可以进一步改善淋巴恢复。这些结果强调了聚乙二醇化在皮下给药后增强树枝状聚合物-药物复合物吸收到淋巴中的潜力。

例 40

PEG 50% 药代动力学₅₇₀封装的聚-L-赖氨酸树枝状聚合物

方法

【0392】树状聚合物与血管或组织表面的结合潜力是通过如下测量与肝脏替代匀浆的结合来估计的：用盐水灌注麻醉大鼠的肝脏以从杯中去除大部分血液。然后分离肝脏并在玻璃匀浆器中在 1:1 w/v 盐水溶液中浸渍。大鼠通过心脏穿刺和致命注射 lethabarr 实施安乐死。一旦肝脏明显均质化，将大约 1 mL 的肝脏匀浆添加到微量离心管中，并以 3500 rpm 的速度旋转 5 分钟。去除上清液并向每个管中加入额外的 500 µl 盐水。将每个试管短暂涡旋并再次离心。该程序确保尽可能多地从匀浆中去除可溶性蛋白质，以最小化可结合树枝状聚合物并被计为未结合树枝状聚合物的蛋白质的量。向每个试管中额外添加 500 µl 生理盐水和 50 µg Lys。_十六（联系₅₇₀)_十六(CH_3个)_十六, 赖氨酸_十六（联系₅₇₀)_十六(N.H_2个)_十六你的光_8个(D-lis)_十六添加到每个管中。 D-lys 树状聚合物用作未封端的阳离子树状聚合物对照，因为它不会经历可能影响结合实验结果的快速代谢。每个试管在 37°C 下在旋转振荡器上孵育 30 分钟，然后再次离心。收集上清液并分析“未结合的”树枝状聚合物。如别处所述溶解剩余的肝匀浆以确保剩余的树枝状聚合物与肝组织结合。

结果：

赖氨酸_十六（联系₅₇₀)_十六(N.H_2个)_十六*

【0394】1 小时后，血浆放射性示踪剂的消耗急剧减少，终末半衰期（在 6 至 30 小时内计算）为 22.1 ± 2.1 小时。体积排阻层析（图拉 25A) 表明在给药后 2 小时血浆中存在氚化赖氨酸，并且还表明血浆中存在的主要物质明显大于树枝状聚合物。因此，大约 1 天的终末半衰期可能反映了通过再摄取释放的氚化赖氨酸产生的血浆蛋白的清除。

赖氨酸_十六（联系₅₇₀)_十六(CH_3个)_十六*

【0396】半乙酰化树状聚体的放射性示踪剂的初始血浆分布与半聚乙二醇化树状聚体的相似（半衰期 = 9.3 ± 0.42 分钟）（图 24).然而，与半聚乙二醇化树枝状大分子相比，半乙酰化树枝状大分子的终末半衰期更短，并且与完全聚乙二醇化树枝状大分子的终末半衰期更一致（半乙酰化树枝状大分子为 13.9 ± 0.3 小时 vs . 9.45 ± 0.42 小时（对于完全聚乙二醇化的树枝状聚合物）。这可能是由于与半聚乙二醇化树枝状聚合物相比，半乙酰化树枝状聚合物在细胞核中的代谢速度较慢。图 27A).血浆 SEC 曲线显示在 t0 时，血浆放射性标记已完全分配给完整的树枝状聚合物。给药后 2 小时收集的血浆显示出归因于完整树枝状聚合物的小峰和 20 分钟时的宽峰（该峰比完整树枝状聚合物早 2 分钟洗脱），但没有明显的游离赖氨酸。与半聚乙二醇化树枝状聚合物一样，大部分注射的放射性标记在 30 小时尿液中排出 (72.3 ± 1.2%)，并且大部分以原样排出。在 8-24 小时尿液中鉴定出数种小分子量物质，它们归因于树枝状聚合物的代谢产物。图 27B，注意 8-24 小时的不同比例）。

赖氨酸_十六（联系₅₇₀)_十六(甲氨蝶呤)_十六

【0397】尽管 MTX 树状聚合物的分子量与完全聚乙二醇化树状聚合物的分子量相似，但血浆分布更接近于半乙酰化树状聚合物的分布。初始血浆半衰期为 15.4 ± 2.4 分钟，比其他半包衣树枝状聚合物的半衰期稍慢。末端消除半衰期与完全聚乙二醇化树枝状聚合物的半衰期基本相同 (9 ± 0.2 h)，可能反映了末端血浆清除率对总分子量的依赖性。

结论：

参考

[0401]应当理解，本说明书中描述和定义的本发明扩展到文本或附图中提到的或显而易见的两个或多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合形成了本发明的各种可供选择的方面。